北京諾博萊德科技有限公司

　　① 凝膠類型

　　用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時(shí)，凝膠板*浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。

　　② 緩沖液系統(tǒng)

　　缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢;相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)造成膠熔化和DNA的變性。

　　常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。

　　TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長(zhǎng)期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5×溶液，用時(shí)稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。

　　③ 凝膠的制備

　　以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。

　　④ 樣品配制與加樣

　　DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

　　⑤ 電泳

　　瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，較大的DNA片段遷移率的增加相對(duì)較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。

　　電泳系統(tǒng)的溫度對(duì)于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時(shí)，為增加凝膠硬度，可在4℃進(jìn)行電泳。

　　⑥ 染色和拍照

　　常用熒光染料溴乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析